Sinh ra tại Milwaukee, Wisconsin, ông nhận bằng cử nhân và thạc sĩ ngành Toán học năm 1960 tại Học viện Kỹ thuật Case (nay là một phần của trường Đại học Bách khoa Case Western). Năm 1963, ông lấy bằng tiến sĩ Toán tại Học viện Kỹ thuật California, nơi ông trở thành giáo sư và bắt đầu viết cuốn Nghệ thuật lập trình máy tinh, thoạt tiên được dự tính là một bộ bảy tập. Năm 1968, ông xuất bản tập thứ nhất. Cùng năm đó, ông vào dạy tại trường Stanford.

Năm 1971, ông là người đầu tiên nhận giải Grace Murray Hopper do Hiệp hội Máy tính (ACM) trao tặng. Ông đã nhận được nhiều giải khác, trong đó có giải Turing, Huy chương Khoa học Quốc gia, Huy chương John von Neumann, và giải Kyoto. Sau khi xuất bản tập thứ ba của bộ sách mình, ông tỏ vẻ bực tức với các dụng cụ xuất bản cổ lỗ sĩ của thời đó và tự tay tạo ra các dụng cụ TEX và METAFONT.

Vì các đóng góp của ông vào lĩnh vực khoa học máy tính, trong năm 1990 ông được tặng chức vị đặc biệt Giáo sư Nghệ thuật lập trình máy tính và sau này được đổi thành Giáo sư danh dự Nghệ thuật lập trình máy tính.

Năm 1992 ông trở thành một thành viên trong Viện Hàn lâm Khoa học Pháp. Trong năm đó ông ngừng giảng dạy và nghiên cứu tại Đại học Stanford để hoàn tất bộ Nghệ thuật Lập trình Máy tính. Năm 2003 ông được bầu vào Học hội Hoàng gia Anh (Royal Society). Đến năm 2004, ba quyển đầu của bộ sách của ông đã được tái bản, và ông đang viết cuốn thứ tư, bản thảo được thường xuyên cập nhật trên trang web của ông. Trong thời gian này, mỗi năm ông có những buổi diễn giảng không chính thức tại Đại học Stanford. Ông cũng là giáo sư thỉnh giảng tại Phòng thực nghiệm tính toán của Đại học Oxford, vương quốc Anh.

Ngoài những tác phẩm về Khoa học máy tính, Knuth cũng là tác giả của cuốn 3:16 Bible Texts Illuminated (1991), ISBN 0-89579-252-4, trong đó ông cố gắng nghiên cứu Kinh Thánh bằng phương pháp lấy mẫu phân tầng ngẫu nhiên, tức là phân tích dòng 16, chương 3 trong mỗi quyển kinh. Mỗi dòng này được đi kèm với một minh họa bằng nghệ thuật viết chữ do nhóm các nhà thư pháp đứng đầu là Hermann Zapf đóng góp.